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Sarah Panera Martínez, Universidad de León; Carlos Alonso Calleja, Universidad de León; Cristina Rodríguez Melcón, Universidad de León; Rosa Capita González, Universidad de León y Víctor Serrano Galán, Universidad de León
A estas alturas de la pandemia todos hemos oído hablar de la técnica de la PCR. A muchos de nosotros nos han realizado la prueba o, al menos, todos tenemos algún familiar o amigo que se ha sometido al test. Pero, ¿sabemos qué es una PCR y cuándo se utiliza? ¿Tenemos claro cuáles son los errores más comunes que pueden surgir?
Empecemos por aclarar que la PCR es una técnica de biología molecular que se lleva aplicando en el campo de la investigación desde hace más de tres décadas. Desarrollada en 1986 por el bioquímico estadounidense Kary Mullis, se basa en una reacción enzimática mediada por la polimerasa. De ahí su nombre, derivado de las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction (Reacción en Cadena de la Polimerasa, PCR).
La polimerasa es una proteína que está presente en todas las células de cualquier ser vivo y se encarga de duplicar el material genético –el ADN– en los momentos previos a la división celular. Con la PCR aprovechamos esta habilidad de la enzima para realizar muchas copias de un fragmento concreto de ADN.
5. Reacción de amplificación
El siguiente momento crítico se produce durante la propia reacción de amplificación del fragmento. Se trata de la repetición sucesiva de 3 simples pasos, que conforman un ciclo de amplificación:
- Desnaturalización. Separación de las 2 hebras que conforman el ADN mediante la aplicación de calor (95 ºC).
- Anillamiento. Colocación de los cebadores en la posición adecuada para marcar el fragmento a copiar. La temperatura debe descender aproximadamente a 60 ºC.
- Elongación: Adición de los nucleótidos, uno a uno, por parte de la polimerasa, desde la posición en la que se colocan los cebadores. Aquí la temperatura debe rondar los 72 ºC.
Cada vez que se termina un ciclo de amplificación, se duplica la cantidad de fragmento de ADN que teníamos en un principio. Si partimos de una única copia del fragmento y hacemos 20 ciclos de amplificación, al final de la reacción tendremos aproximadamente 1 millón de copias del fragmento inicial.
Esquema de la reacción de la PCR. Grupo SEGURALI.
6. Revelado de los resultados
Finalmente, para saber si se han realizado correctamente las copias de nuestro fragmento, habría que revelar los resultados. Para ello, se pueden distinguir dos tipos básicos de PCR:
- PCR convencional: habría que revelar cada muestra analizada utilizando una técnica conocida como electroforesis en gel de agarosa. Esta herramienta nos permite separar los fragmentos copiados en función de su tamaño. Si la muestra es positiva a un microorganismo o tiene un gen que estamos buscando (por ejemplo, de resistencia a un determinado antibiótico), aparecerá una línea en el gel correspondiente a nuestro fragmento de interés. Si, por el contrario, la muestra es negativa, no se observará ninguna línea.
Ejemplo de un gel de agarosa con 6 columnas correspondientes (de izquierda a derecha) con un marcador de tamaño del fragmento de ADN, un control negativo, un control positivo y tres columnas correspondientes a las muestras analizadas: muestra 1 (positiva), muestra 2 (negativa) y muestra 3 (positiva). Grupo SEGURALI.
- PCR en tiempo real: en este caso el proceso es ligeramente diferente, ya que habría que añadir un componente en el inicio de la reacción. Se trata de un compuesto, llamado fluorocromo, capaz de emitir fluorescencia cada vez que se hace una copia nueva de nuestro fragmento. Se necesita una máquina capaz de medir estos niveles de fluorescencia durante todo el proceso de amplificación. Las muestras serán positivas si superan un límite de fluorescencia preestablecido.Esta técnica también permite determinar la concentración que hay, en cada muestra, de un determinado microorganismo, en función de cuántos ciclos de amplificación tarde en superar dicho límite marcado. Cuanto mayor sea la concentración del microorganismo en la muestra, menor será el número de ciclos necesarios para la detección de la fluorescencia.
Ejemplo de resultados de una PCR en tiempo real. La línea azul (muestra 1) y la línea verde (muestra 3) se corresponden con dos muestras positivas, ya que en ambos casos se supera el límite de fluorescencia marcado (línea roja). La muestra 1 tiene más concentración del microorganismo que la muestra 3, porque supera el límite de fluorescencia varios ciclos de amplificación antes. La línea morada (muestra 2) se corresponde con una muestra negativa.Grupo SEGURALI.
Parece que la pregunta que daba pie a este artículo, ¿cuándo es útil y cuándo no la prueba de la PCR?, no tiene una única respuesta válida. Se utilizará siempre y cuando se quiera copiar un determinado fragmento de ADN. Y, como hemos visto, esto puede aplicarse a multitud de situaciones diferentes (y no solo para diagnosticar infecciones por coronavirus).
Además, si queremos que su uso sea el correcto, habrá que tener en cuenta una serie de puntos críticos cuya alteración podría derivar en un resultado erróneo. Aun así, se trata de una prueba tan sensible y específica que estos errores son muy poco frecuentes.
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Sarah Panera Martínez, Contratada predoctoral – Seguridad Alimentaria y Microbiología de los Alimentos, Universidad de León; Carlos Alonso Calleja, Catedrático de Universidad, Área de Conocimiento de Nutrición y Bromatología, Facultad de Veterinaria, Universidad de León; Cristina Rodríguez Melcón, Contratada predoctoral – Seguridad Alimentaria y Microbiología de los Alimentos, Universidad de León; Rosa Capita González, Catedrática de Universidad, Área de Conocimiento de Nutrición y Bromatología, Facultad de Veterinaria, Universidad de León y Víctor Serrano Galán, Técnico de Apoyo a la Investigación, Universidad de León
Este artículo fue publicado originalmente en The Conversation. Lea el original.